HPLC

Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Prinsip Dasar HPLC

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

             Prinsip dari HPLC ini adalah dinamika dan migrasi dengan meggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan semakin baik.

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:

 

ALAT DAN CARA KERJA HPLC

A. Rangkaian Alat HPLC

1. Kolom

Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Kolom Yang Baik :

Jenis Kolom :

Pemeliharan Kolom :

2. Komposisi Eluen

Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.

 Tempat Eluen berupa Botol yang tidak bereaksi dengan pelarut, dilengkapi penyaring. Eluen harus disaring dengan saringan membran

3. Volume Injeksi

Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value.

4. Detektor

Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.

Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu:

1. Detektor spektrofotometrik

Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sampel yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detektor yang sangat mahal. Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.

2. Detektor Fluorometrik

Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya.

3. Detektor Elektrokimia

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solute yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik.

4. Desain detector

Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter.

5. Pemilihan detektor

Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut :

6. Analisis Kuantitatif

Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut, konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram.

Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuat kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.

Syarat Detektor :

B. Fase HPLC

HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair, dapat digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis.

Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi :

2.3 APLIKASI HPLC DALAM KEHIDUPAN

A. Keunggulan dan Kerugian HPLC

KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan analisis. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Kelebihan KCKT antara lain adalah :

Beberapa keunggulan HPLC dibanding alat lain:

a). HPLC dilengkapi dengan adanya pompa, Pompa ini menghasilkan tekanan sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu lebih sedikit. pada pompa dikenal dua sistem dalam teknik pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih bersifat akurat karena masing-masing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda.

b). HPLC memiliki keunggulan kolom, Dimana kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC ≤ 4.6 mm sehingga dapat memberikan permukaan kontak yang lebih luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat adalah kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai.

c). HPLC mempunyai detektor yang amat sangat sensitif dan peka. HPLC memiliki beberapa detector misalnya: Detektor ultraviolet, detektor fluorometrik, dan detektor elektrokimia.

d). Waktu retensi, waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detektor disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.biasanya dipengaruhi oleh : tekanan yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat, dan temperatur kolom.

e). Kromatogram, kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram yang diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil mungkin. Bukan dengan bentuk lainnya,karena bentuk tersebut menandakan pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun dalam kromatogram kita menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut denga noise. Noise muncul jika sampel kita ataupun pelarut yang kita gunakan belum pure,belum murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk kedalamnya.

Fasa gerak dalam HPLC memegang peranan penting karena sangat akan mempengaruhi kepada pemisahan,jadi ada beberapa kriteria yang harus dipenuhi fasa gerak :

Sedangkan kelemahan dari penggunaan HPLC yaitu :

C. Aplikasi HPLC dalam Kehidupan Sehari-hari

Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :